Приложение 10
(обязательное)
Общие требования к контролю содержания микроорганизмов в воздухе рабочей зоны
1. Общие положения
1.1. Методика определяет требования к измерению в воздухе рабочей зоны концентраций микроорганизмов, живых клеток и спор, находящихся в составе товарных форм бактериальных препаратов, на биотехнологических предприятиях, а также в воздухе общественных и промышленных зданий.
1.2. К использованию в технологических процессах допускаются штаммы микроорганизмов, разрешенные к применению Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
1.3. Контроль воздуха на содержание вредных веществ биологической природы - продуктов микробного синтеза (ферменты, витамины, антибиотики и др.) проводится так, как это принято для химических веществ.
2. Требования к отбору проб
2.1. Отбор проб воздуха для контроля содержания микроорганизмов проводится путем аспирации их из воздуха на поверхность плотной питательной среды.
2.2. Отбору проб должна предшествовать краткая характеристика микроорганизмов: указываются семейство, род, вид, штамм, морфологическая характеристика колоний на твердой питательной среде и оптимальные условия роста колоний на твердой питательной среде (рН, Т°).
2.3. Отбор проб воздуха проводят:
• при засеве инокуляторов в зоне дыхания и между инокуляторами;
• при отборе проб из инокуляторов;
• при засеве посевных аппаратов (при условии прямого засеивания);
• при отборе проб из посевных аппаратов у пробника и между посевными аппаратами;
• при отборе проб из ферментеров;
• при спуске культуральной жидкости из ферментеров в коагуляторы или прямо на фильтрацию.
Если в технологическом процессе имеет место сушка биомассы, то отбор проб проводится:
• при перемешивании;
• при выгрузке из сушильных аппаратов;
• при фасовке биомассы.
Перечисленные точки отбора ориентировочные и на каждом предприятии устанавливаются индивидуально с учетом данных валидации, характеристик процесса, методологии тестирования и т. п.
2.4. При текущем контроле в одном помещении число контрольных точек должно быть не менее трех.
2.5. Для сравнительного анализа концентраций микроорганизмов в воздухе рабочей зоны отбор проб должен проводиться не реже 1 раза в неделю в аналогичной по интенсивности технологического процесса временной период.
2.6. Объем пробы воздуха должен быть достаточным для обнаружения микроорганизмов. Он устанавливается опытным путем с учетом характеристик используемого пробоотборника и концентрации микроорганизмов в тестируемой зоне.
Примечание.
Для импакторов и центрифужных пробоотборников одним из ограничивающих факторов является высыхание поверхности агара при больших объемах проб, а так же возможность повреждения поверхности агарового слоя (растрескивание).2.7. Отбор проб проводится с концентрированием воздуха на чашке Петри с посевной средой.
Отбор проб на содержание микроорганизмов проводят в рабочей зоне; высота установки прибора 1,5 м от уровня пола.
3. Характеристика метода
3.1. Метод основан на аспирации микроорганизмов из воздуха на поверхность плотных питательных сред - элективных (избирательных для данного микроорганизма) или элективно-дифференциальных (путем добавления в среду ингибиторов - антибиотики, желчь, молочная кислота, красители; цветных индикаторов или других специфических химических веществ, позволяющих выявить диагностические признаки данного микроорганизма). После инкубации в термостате производится подсчет выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
Примечания.
1. Выбор питательной среды является одним из важных факторов. Базовой средой для культивирования бактерий является среда № 1(МПА)*, среда № 2 (агар Сабуро) и солодовый агар для культивирования дрожжей и мицелиальных грибов**. Посевы бактерий выращивают в термостате при t 35—40 °С в течение 24—48 ч, культуры дрожжей и грибов - при 125—30 °С в течение 72 и более часов.
2. Перед отбором проб разлитые на чашки Петри или пластины питательные среды выдерживают в термостате при t 37 °С в течение 24 ч для подтверждения стерильности. Проросшие чашки бракуют.
3. Ростовые свойства питательных сред должны быть проверены соответствующими тест-штаммами.
3.2. Микроорганизмы, выросшие на чашке Петри, подлежат макро- и микроскопической идентификации. К макроскопическим признакам относятся форма и размеры колоний, цвет, консистенция, к микроскопическим признакам - форма (кокки, бациллы, овоиды и т. п.), подвижность (количество жгутиков), отношение к окраске по Граму, наличие спор и капсул.
3.3. Для дальнейшей индикации и дифференциации микроорганизмов могут быть использованы биохимические методы, различные автоматизированные системы, а также любые современные методы идентификации микроорганизмов.
3.4. Предел измерения от 1 до 5 x 106кл/м3.
4. Приборы и посуда
4.1. Для бактериологического анализа воздуха используют импактор воздуха микробиологический “Флора-100” (ТУ 64-098-33—95).
Примечание.
Современная отечественная модель - высокопроизводительный импактор “Флора 100” работает в автоматическом режиме, отбирает заданный объем воздуха и осаждает биологический аэрозоль на чашку Петри с плотной питательной средой. Импактор полностью заменяет широко используемый для контроля прибор Кротова и превосходит его по всем техническим характеристикам (точность определения, масса, габариты, скорость пробоотбора, автоматический контроль параметров пробоотбора и диагностики неисправностей).Импактор “Флора 100” прошел государственные испытания и рекомендован Комитетом по новой технике (протокол № 7 от 26.12.95) к применению в медицинской практике.
4.2. Методику проведения контроля с использованием импактора “Флора-100” рекомендуется согласовывать с разработчиком импактора для уточнения времени аспирации в зависимости от особенностей контролируемой микрофлоры.
4.3. Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (ТУ 64-1-791—77).
4.4 Секундомер ГОСТ 9586—75
4.5. Чашки бактериологические, плоскодонные, стеклянные диаметром 100 мм, ГОСТ 10937—75.
4.6. Термостаты электрические суховоздушные, типа ТС, ТУ 64-1-1382—76.
4.7. Пипетки мерные, ГОСТ 1770—74.
4.8. Колбы конические, ГОСТ 1770—74.
4.9. Весы аналитические ВЛА-200-М.
4.10. Камера для стерильной сушки чашек Петри типа ЕМЗ 804-014СП.
5. Методика проведения контроля
5.1. Воздух аспирируют со скоростью от 10—20 до 150—200 л/мин на поверхность плотной питательной среды на чашках Петри.
5.2. Время аспирации (2—10 мин) зависит от концентрации микроорганизма в воздухе.
5.3. Термостатирование чашек Петри с пробами воздуха производится при температуре 25—40 °С в зависимости от биологической характеристики микроорганизма.
5.4. Метод предполагает учет по типичным морфологическим признакам количества колоний, выросших на 2—4 сутки и более после посева пробы воздуха в зависимости от видовой принадлежности микроорганизма.
5.5. Прямой метод позволяет учитывать на чашке Петри до 150—200 колоний. Результаты рассчитывают в кл/м3 .
Примечание.
Проблемной комиссии по гигиеническому нормированию с целью унификации методических подходов принято согласованное решение единицей измерения принять “клетки” (а не колониеобразующие клетки, хотя это правильно).Единицы измерения указывать обязательно.
К = П • 1 000/С • t кл/м3, где
К - концентрация микроорганизма в воздухе, кл/м3;
П - количество изотипов микроорганизма (сходных по морфологии колоний), вьфосших на чашке Петри;
1 000 - коэффициент пересчета 1 л в 1 м3 воздуха;
С - скорость аспирации, л/мин;
t - время аспирации, мин.
5.6. Результаты замеров вносят в протокол.
Протокол
оценки содержания промышленных штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны (рекомендуемый)
Дата_________________________________
1. Ф., И., О. работающего (рабочее место)_______________________________________________________
____________________________________________________________________________________________
2. Профессия________________________________________________________________________________
3. Производство __________________
4. Участок (технологическая стадия, операция)___________________________________________________
5. Точка отбора (наименование оборудования у которого производится отбор)________________________
____________________________________________________________________________________________
6. Вид пробоотборника ____________
7. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб___________________________
8. Микроорганизм, содержание которого контролируется (род, вид, штамм)___________________________
9. Питательная среда, оптимум роста, время инкубации _____________
10. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (морфологические признаки - форма, цвет, консистенция; окраска по Граму; количество типичных колоний)__________________________________
_______________________________________________________________________________________________
11. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода___________________________________
_______________________________________________________________________________________________
12. Результаты расчёта концентрации микроорганизма (кл/м3)__________________________________________
_______________________________________________________________________________________________
13. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКр.з.__________________________________________
_______________________________________________________________________________________________
Отбор пробы произведен:
(Ф., И., О., должность) (подпись, дата)
Идентификация штамма и расчёт концентрации произведен:
(Ф., И., О., должность); (подпись, дата)